中国の捕獲ベルーガ（Delphinapterus leucas）の新種血コルナウイルス同定及びゲノム分析

サンプル収集

サンプリング手順は、海南大学医学部倫理委員会の承認をいただきました（承認番号：HMUEC20180059）。 合計28個の口腔綿棒、喉綿棒と綿棒サンプルが12匹の捕獲されたベルーガから収集されました（デルファイナフテルス類カス）2018年1月から中国Dalian Sun Asia Tourism Holding Co.、Qingdao Polar Haichang Ocean Parkから。 サンプルをウイルスサンプリングチューブ（Yocon、Beijing、China）の維持管理培地に浸し、24時間以内に実験室に移動しました。 hコールドチェーン輸送を使用して、-80℃で保管します。

ウイルス核酸ライブラリを構築し、次世代シーケンシング

すべての28個のサンプルは、サンプリング時間に応じて、2つのプールの結合された0.45μmのフィルターを通過しました。 収集された濾液をDNase（Applied Biosystems、Waltham、MA、USA）に分解して保護されていない核酸を除去した。 メーカーの指示に従ってQIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を使用して総RNAを抽出しました。 cDNAはSuperscript III逆転写酵素（Invitrogen社、Waltham、MA、USA）を使用して作成されました。 増幅されたウイルス核酸のライブラリは、長さが100bpである単一の測定値についてHiSeq2500シーケンサ（Illumina、San Diego、CA、USA）で分析された。 生シーケンスを読むには、有効なシーケンスを得るために、以前に説明した基準を使用してフィルタリングされた。¹⁴。

分類学的割り当て

シーケンス類似性に基づい分類の割り当ては、以前に説明したとおりに実行されました。¹⁴。 簡単に言えば、それぞれBLASTnおよびBLASTxを使用して、国立バイオテクノロジー情報センターの非冗長（NR）ヌクレオチドおよび蛋白質データベースとの位置合わせを行い、ウイルスの起源について、各測定値を評価しました（予想値<10^-5、F：フィルタクエリシーケンス、デフォルト= T）。 最高のBLASTスコアを持つソートされた読み取りの分類（イジャヒョン– 値<10^-5）メタゲノム解析（MEGAN）6を使用して、すべてのレーンで解析しエクスポートしました。¹⁵。

ゲノムシーケンシング

メタゲノム解析によって提供され、分子の手がかりは、MEGAN 6を使用して、配列の読み取りをウイルスファミリーまたは属に分類するために使用された。 ウイルスRNAは、QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）を使用して分離され、cDNAは、ランダムプライマーとSuperscript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）を使用して作成されました。 ）メーカーの指示に従ってください。 遺伝子特異的プライマーは、ネストされたPCR増幅およびSangerシークエンシングによって部分ゲノムを覆うように確保しながら、新しいpicornavirusの代表的な識別測定値を基に設計されました。 残りgenomic sequenceはgenome-walking kit（Takara、Kusatsu、Japan）を用いて増幅し、全体の5′-end sequenceと3′-end sequenceは5′-RACE system version 2.0 comboを利用して、繰り返し増幅して得た。 Invitrogen）とPrimeScript RTaseを含む3′-Full RACEコアセット（Takara）を製造元の指示に従います。 すべてのプライマー配列は、新たに得られたリードと、新た増幅されたシーケンスに基づいています。 使用されたすべてのプライマーは、オンライン補充表S1に記載されています。

被コールやウイルス検出

末端を増幅して得られたウイルスのゲノム配列を使用して、12個の取得ベルーガから収集した28個の綿球のサンプルから血コールやウイルスをスクリーニングするためにnested-PCRのための特定のプライマーを設計した。 PCRはKOD One PCR Master Mix（Takara）を使用して実行されており、最初のPCRラウンドは、外部プライマー（F：5′-AGCAGTTACCTTGCCCACG-3 ‘及びR：5′-TCCCTGCTCGCACCTTG-3’）でプライミングされた第二PCRラウンドは、内部プライマー（F：5’-CGCCTGAGACTGGTGT-3 ‘及びR：5’-TTGCCATTGGGTGTAA-3’）でプライミングされた。 最初のラウンドのPCR産物（1μL）を、第二ラウンドの反応のテンプレートとして使用しました。 最初のラウンドPCRのための熱サイクリング条件は、98℃で5分、次いで98℃で10秒、50℃で5秒、68℃で5秒、最終身長のステップは、68℃で1分で35回繰り返した。 ; そして第二ラウンドのPCRは、98℃で5分、次いで98℃で10秒、58℃で5秒、68℃で5秒、最終身長のステップは、68℃で1分の35サイクルであった。 最後に、PCR産物を1％アガロースゲル電気泳動紫外線映像で分析した。 陽性サンプルは642bp増幅産物の存在によって決定された。 すべてのPCR産物は、Sangerシークエンシングによって追加検証されました。

ゲノム注釈と系統発生分析

5′-UTRにIRES類似配列を含むPicornavirusはBLAST検索によって確認された。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）GenBankデータベースのウイルス序列。 picornavirus 5′-UTRの二次/ 3次構造の要素は、ViennaRNA Web Servicesの配置されたRNAalifoldサーバーを使用してモデリングされて（http://rna.tbi.univie.ac.at/）。 メガ6.0（http://www.megasoftware.net）¹⁵ 基本的なパラメータがあるMUSCLEパッケージを使用してntシーケンスをソートし、そのaaシーケンスを推論するために使用された。 P1と3Dのアミノ酸配列に基づいてpicornaviruses間の関係を示す系統発生数は最大可能性mtREV with Freqs（+ F）のモデルは、不変の部位に分布されたガンマ（G + I）および1000ブートストラップ複製を使用して作成れました。 日常的な配列の整列はClustal Omega、EMBOSS Needleを使用して行われました（両方： http://www.ebi.ac.uk/Tools/）、MegAlignとLasergene（DNAstar、Madison、WI、USA）とT-コーヒー（http://www.tcoffee.org/）手動キュレーションを含む。 ゲノムのnt配列とORFのaa配列は、他の被コールやウイルスと比較して推論した。 PfamとInterProScan 5を使用して保存されたタンパク質ファミリーとドメインを予測しました。 http://www.ebi.ac.uk/services/proteins）。 アミノ酸のアイデンティティと遺伝的距離はMLの方法を使用して計算され、距離測定法でサンビョル進化距離の計算を使用して行われました。

動物の権利宣言

動物は、実験動物の管理規定（1988年中華人民共和国国家科学技術委員会施行令2号）の指示に従って処理した。 サンプリング手順は、海南大学医学部倫理委員会の承認を受けました。