手術中に尿管を識別するための近赤外線蛍光剤ASP5354の準備された血管透過性は、癌腫組織のイメージングを可能にします。

実験動物

すべての実験プロトコルは、ITechLAB Co.、Ltd.の機関動物管理および使用委員会（登録番号：ITL-21-MV-321）およびMie大学動物倫理委員会（登録番号：MIE23-37）によって承認されました。 すべての方法は、日本科学委員会、ITechLAB Co.、Ltd.の機関動物管理および使用委員会、およびMie University動物倫理委員会によって発行された指示に従って行われました。 本研究は、ARRIVE指令に従って実施した。 BALB/cSlc-nuマウス（雄；年齢：5週；平均体重：20g）は、日本SLC、Inc.（日本静岡製）から購入した。 全てのマウスは、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射して麻酔した後、実験を開始する前に、２０〜２５℃の特定の病原体を含まない条件で６日間受けた。 ）。 Wistarラット（男性、13週齢、平均体重：300g）は、Japan SLC Inc.（日本静岡）から購入しました。 全てのラットは、実験前に２２〜２４℃の特定の病原体を含まない条件で受け入れた。 生理食塩水中のペントバルビタールナトリウム塩を用いてラットを麻酔した。

材料

ASP5354、以前TK-1（C₁₃₅時間₁₉₇N₄永久₇₃Cl、分子量：3079）は、前述のように調製した（Suppl. 図3およびSuppl. ASP5354の合成手順）。⁸。 本研究では、RPMI-1640(FUJIFILM Wako Chemicals Co., Ltd., 日本大阪)、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(5000 U/mL; Thermo Fisher Scientific KK、日本東京)、ウシ胎児血清などの試薬を使用しました。 (FBS; MP Bio Japan, Tokyo, Japan), ケタミン(Daiichi Sankyo Propharma Co., Ltd., Tokyo, Japan), メデトミジン(Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd., Tokyo, Japan), ペントバルビタールナトリウム塩（TCI Japan、日本東京）、生理食塩水（Otsuka Pharmaceutical Co.、Ltd.、東京、日本）、ヒスタミン（Wako Chemicals Co., Ltd.、日本大阪）、ICG（MP Biomedicals、LLC、Solon、OH、USA） 。 化学物質リストは、補足情報（化学物質およびツールの供給リスト）にあります。

楽器

NIRFイメージングは​​、ICGに最適化された臨床的に利用可能なPhotodynamic Eyeカメラシステム（PDE、Hamatsu Photonics KK、Shizuoka、Japan、Suppl. Fig. 4）を用いて行われ、励起用760nm発光ダイオードと電荷結合検出装置。 NIRF検出用の光学ハイパスフィルタは、電荷結合素子検出器の前に配置されています。 ビデオ画像はパーソナルコンピュータを使用して記録された。 測定条件は次のとおりです。明るさ、6 au。 コントラスト、5au。 ここのレベル、1–10 au。 癌腫イメージングのin vivo調査において、関心領域を用いて、癌腫中心と正常組織（5mm×5mm正方形）のNIRF強度と、癌腫と正常組織の横軸のNIRF強度を分析した。 分析プログラム（浜松フォトニクス株式会社）。 PDEカメラシステムは人の目で直接観察するためのものであり、非線形性は機器ソフトウェアに組み込まれています。 ASP5354の血管透過性インビボイメージングのために、ヒスタミン注射部位、生理食塩水注射部位、非治療部位のNIRF強度を分析した。 組織切片およびKYSE850細胞のNIRF顕微鏡観察は、対物レンズPlan-Apochromat 20×/0.75（Carl Zeiss Co.、Ltd.）および白黒カメラ（Axio CamMRm; Carl Zeiss Co.、Ltd.）。 微細なNIRFは、IR Dye 800用の41037 Li-Corフィルターセットを使用して、1×1のビニングモードを使用して60秒間暗所で測定しました（励起帯域通過、720〜760 nm、放出長距離通過、> 780 nm、 Chroma Technology、Bellows Falls、VT、USA）、AxioVision 4.8ソフトウェア（Carl Zeiss Co.、Ltd.）を使用して画像を得た。 E8400カメラ（Nikon Corp.）を備えたECLIPSE E600顕微鏡（Nikon Corp.、Tokyo、Japan）を使用して、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色した切片を観察した。 ツールリストは補足情報（化学物質およびツールリスト）にあります。

細胞株、細胞培養およびマウスモデルの調製

KYSE850細胞（ヒト食道扁平癌細胞）は、JCRB Cell Bank（Osaka、Japan）から購入した。 細胞を、10％FBSおよび抗生物質溶液（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含むRPMI-1640培地で37℃および5％CO2で培養した。₂。 培養後、細胞をRPMI-1640で洗浄し、細胞懸濁液（7.5×10）⁷ 細胞／ｍＬ）を調製した。 ヌードマウスを麻酔し、細胞懸濁液（０．２ｍＬ）を２５−Ｇ針を用いて首に皮下注射した。 RPMI-1640（0.2mL）をビヒクル対照として健康なマウスの首に注射した。 ASP5354は静脈注射後すぐに腎臓に移動し、強力なNIRF信号を放出します。^6,9。 したがって、この研究では、腎臓からのNIRF放出による干渉を減らすために、KYSE850癌細胞を首の後ろの皮膚の下に移植しました。 全てのマウスを18日間受け取り、その後NIRFイメージングを行った。 腫瘍の大きさは、長辺が15.2±2.4mm、短辺が11.5±1.1mmであった（平均±標準偏差（SD））（N= 10ラット）NIRFイメージングで。

in vivo NIRFがんイメージング

KYSE850がん腫異種移植（N= ASP5354 の場合 7 と N= ICGの場合3）およびビヒクルコントロールマウス（N= ASP5354の場合3と NＩＣＧの場合＝３）に、ＡＳＰ５３５４／生理食塩水（２４μｍｏｌ／Ｌ）またはＩＣＧ／生理食塩水（２４μｍｏｌ／Ｌ）を１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の用量で尾に静脈注射した。 これは、PDEカメラシステムを用いたMKN-45癌マウスイメージングの以前の実験に適していたからである。¹⁴ 身体の非毒性変化がイメージング実験中に観察され、この用量はこの研究ですべてのマウスに適用された。 インフルエンザ全体のNIRFイメージングは​​、ASP5354またはICG注入後0（ASP5354またはICG注入前）、0.5、5、10、および30分でPDEカメラシステムを使用して暗闇で行われました。 ASP5354のイメージングは​​、カメラシステムの適切な励起レベル（4au）で行われ、ICGイメージングでは、中間（4au）および高（8au）励起レベルが使用されました。

NIRFイメージングと組織切片の組織病理学的分析

等のin vivoでNIRFイメージング後、マウスを安楽死させ、がんにかかった皮膚を切除した。 組織を凍結および切片化し、暗闇の中でAxiovert 200顕微鏡を用いてNIRFイメージングを行った。 隣接組織の凍結切片をH&Eで染色し、対照として顕微鏡で観察した。

KYSE850細胞におけるASP5354取り込みのin vitro評価

KYSE850細胞（1×10⁵ 細胞／ｍＬ）を、３７℃で１０分間、２．４μｍｏｌ／ＬのＡＳＰ５３５４を含む０．５ｍＬのＰＢＳ溶液中でインキュベートした。 培養液を遠心分離（５００ｒｐｍ、２０℃、５分）し、得られた細胞をＰＢＳ（０．５ｍＬ）で５回洗浄した。 遠心分離した細胞を０．１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁し、白黒カメラを備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００顕微鏡で２０℃で観察し、ＮＩＲＦを測定した。

ASP5354の血管透過性のin vivoNIRFイメージング

ASP5354の血管透過性は、ラットなどのin vivoでのNIRFイメージングを用いて評価した。 腎臓蛍光が背中の血管透過度測定を妨げないように、大きなラットを実験に使用し、生理食塩水とヒスタミン処理を同じ等で評価することができるようにした。 ラットの背中を剃毛し、生理食塩水（３００ｇラットの場合は部位当たり０．０５ｍＬ）またはヒスタミン（生理食塩水中４．５ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｇラットの場合は部位当たり０．０５ｍＬ）を等真皮に注入した。 直ちに、ＡＳＰ５３５４（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）またはＩＣＧ（２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を、注射後０．５、５、１０、３０、６０および９０分で測定されるＮＩＲＦ測定下で尾に静脈注射した。 。 カメラシステムの同じ励起レベルで正常組織、生理食塩水注入組織、およびヒスタミン注入組織の蛍光強度を同時に測定するために、ASP5354およびICGのin vivoNIRF測定のための励起レベルを個別に設定した。

統計分析

NIRFデータは平均値±標準偏差（SD）で表されます。 統計分析は、Student’sを用いて行った。 ティー-試験。