逆pH依存型蛍光蛋白質は水素発生反応中の界面プロトン力学パターンを可視化する

HER中のプロトン力学の指標である蛍光タンパク質

界面プロトン動力学の指標として、これらのタンパク質の性能を評価するために、直径50μmの金微小電極、固定化蛍光タンパク質を作製し、電気化学および蛍光顕微鏡を同時に実施した(図2a)。 記録溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、ＮａＯＨに調整）および１ｍＭ ＮａＣｌで構成された。 まず、0から-1.7までの電位をスキャンし、HERと蛍光反応との相関を調べた。 [V vs. Ag/AgCl] 4つの異なるスキャン速度：0.1、0.2、0.5、1 [V/s]。 青色（489-505 nm）および緑色光（510-560 nm）は、それぞれ脱プロトン化金星およびdKeima形態の励起に使用された。 したがって、蛍光増加は両方のタンパク質の脱プロトン化を示す。 全体的な傾向として、HERと光信号は、Venus（図2b）とdKeima（図2c）のすべてのスキャン速度でよく関連付けられています。 ここで、100nAの電流は〜5.1mA/cmの電流密度に相当します。² 電極面積に対して平均を与えた場合。 特に、これら2つのタンパク質の大きな負電圧（-1.5〜-1.7V）では、主な光学シグナルの方向は、反対のpH依存性にもかかわらず同じ（すなわち、蛍光増加）して、主シグナルがHERによって寄与することを示しています。 – 溶液pH効果ではなく、界面脱プロトン化効果を誘導します。 0.1、0.2、0.5、1のスキャン速度に対する金星信号の半値幅（FWHM） [V/s] は：3.3±0.3（平均±sd; n = 4）、1.7±0.1（n = 2）、0.76±0.05（n = 2）および0.38±0.01（n = 2） [s]、それぞれ。 dKeima信号のFWHMは1.8±0.1（n = 4）、1.0±0.1（n = 3）、0.43±0.05（n = 3）、0.23±0.04（n = 3）です。 [s]、それぞれ。 したがって、dKeimaはVenusよりも鋭い反応を示しました（Welchのt検定、 血< 0.05). 이는 계면 탈양자화 효과와 용액 pH 효과가 금성 신호에서는 건설적으로 작용하지만 dKeima에서는 파괴적으로 작용하기 때문입니다. 낮은 음의 전압 (> – 1.4V）では、dKeimaでわずかな蛍光減少が見られた（図2c、矢印）。 これは、対応する電圧範囲における溶液pH効果の支配を反映する。 図2dは、交差相関分析によって測定された光信号の遅延とスキャン速度を示しています。 dKeimaのより鋭い反応により、Venusと比較して遅延時間が短くなりました。 ＨＥＲと光学シグナルとのこの高い相関は、蛍光タンパク質放出がＨＥＲ中の界面プロトン力学の指標として使用できることを確認した。

4つの異なるスキャン速度でのHERと蛍光タンパク質放出との間の相関関係。 （ㅏ）実験の構成。 （雨）金星に固定された電極の電流および蛍光反応。 （氏) dKeimaを用いた電極の反応 （D）走査速度に対してプロットされた電極電流に対する光信号の遅延。

異種反応環境におけるプロトン枯渇パターン

それから私たちは異質な環境でプロトン力学を可視化しようとしました。 この目的のために、星形または環状の白金／パラジウム（Ｐｔ／Ｐｄ）島を金の表面上に加工した（図３ａ）。 界面脱プロトン化効果と溶液pH効果を直接区別できるため、逆pH依存性を持つdKeimaを指標として使用しました。 図3b、cは、それぞれ0から-1.4Vまでのポテンシャルスキャンによって誘導された電流と全蛍光の代表的な反応を示しています。 ベアゴールド電極では、電流は100nA未満でした（図3b、＃1）。 、Pt/Pd島のある電極で3倍以上向上し、高い触媒特性を検証しました（図3b、#2、3）。 露出した金電極の全dKeima蛍光はわずかに減少し（図3c、＃1）、限られたHERおよび溶液pH効果のみが発生することが示された。 この観察は、図2の結果とも約-1.4Vと一致した。 対照的に、Pt / Pd島を有する電極では、全蛍光の強力な増加が観察された（図3c、＃2、＃3）。 HERによる界面脱量子化効果重要なのは、電流および全蛍光プロファイルがこれらの電極で類似していました（図3c、＃2、＃3）、dKeimaイメージングは​​界面プロトン力学パターンの違いを視覚化しました（図3d、映画S1-S3）。 当初、Pt / Pd触媒の近くの領域で選択的に蛍光減少が検出され（図3d＃2、＃3; t = 11.0秒）、蛍光が増加した。 dKeimaイメージングは​​溶液pH効果とHER駆動界面脱プロトン化効果の最終上昇を可視化した。

dKeimaイメージングによって明らかにされたPt / Pdサブ領域の有無にかかわらず、金電極におけるdKeima信号の時空間力学（ㅏ）分析された電極の例。 バー＝２０μｍ。 （雨）-1.4Vまでの電圧スキャン中の電流応答対時間のプロット。氏）全体の蛍光対時間。 （D）正規化されたdKeima応答の擬似色表現。

さらに、dKeimaイメージングは​​、Pt / Pd島の近位から遠位への光信号の伝播を強調しました（映画S2、S3）。 バルクソリューションが電波を調停できるかどうかを尋ねるために、5〜8μmの幅の間隔を持つ電気的に独立した半円形の電極であるコーヒー豆のような分割微小電極を製造しました。 両方の電極にタンパク質を固定した後、一方の電極でバイアス電圧を走査してHERを活性化し、他方の電極を開いたままにして蛍光イメージングを行った。 ここでは、これをそれぞれ活性電極と停止電極と呼びます。 金星を指標として使用した場合、活性電極で強い蛍光増加が確認された。 静止電極への光信号伝播は検出されなかった（図４ａ、ｂ、映画Ｓ４、Ｓ５）。 プロファイルを綿密に分析した結果、間隔の近くの領域の休止電極で蛍光がわずかに増加したことがわかりました（図4c、d、矢印）。 一方、dKeimaを用いた実験では、活性電極の蛍光が低い負電圧（> – 1.4V）で減少した後、大きな負電圧（< - 1.4V）で強く増加して検出を再現しました。 溶液pH効果とHER駆動界面脱量子化効果の最終活性化（図4e、f、映画S6、S7）。 休止電極では、活性電極に大きな負電圧（＜－１．４Ｖ）を印加すると強度がわずかに低下することが観察され（図４ｇ、ｈ）、これは溶液ｐＨ効果を示す。 総合すると、分割電極を用いた測定は、溶液のｐＨ効果が電極間隔を克服する傾向がある一方、ＨＥＲによるプロトン枯渇はそうではないことを示唆した。 だから私たちは次のような仮説を立てました。 Pt / Pd島で発生するHER駆動プロトン枯渇の伝播（図3d）は、境界に制限されたGrotthussなどのプロトン移動によって媒介されます。 これらの仮定に基づいて、回転対称型＃3電極の時系列画像データの定量的分析を行いました（図S2）。 時点t = 12.5sに焦点を当て、ΔF / F = 10％等高線が伝播する速度を中心から垂直および水平に5μm幅の長方形領域について測定しました。 伝播速度は１４～２６μｍ／ｓと測定された。 電極＃３の電流プロファイルと＃１の電流プロファイル、すなわちＰｔ／Ｐｄ触媒がないことを比較すると（図３ｃ）、ＨＥＲがＰｔ／Ｐｄ触媒領域でのみ発生するという単純化された状況を仮定した。 さらに、5um幅の狭い関心領域では、dKeima信号の伝播は一次元拡散方程式で近似できると仮定しました。 この単純化の下で、拡散係数は、dKeima蛍光の時間導関数（ΔF / ΔT）と伝播方向に対する2次導関数（Δ）の比率として推定されました。²F/(Δx)²）。 t = 12.2および12.3sの4方向について測定された拡散係数の範囲は16〜180μmです。²/ s（図S2）。

HERと蛍光蛋白質放出との間の空間相関 （ㅏ、 雨）左のポテンシャルスキャンによって誘導された金星蛍光の代表的な反応（ㅏ）または右（雨）電極。 アスタリスクは、負のピーク電位（-1.7V）の画像フレームを表します。 （氏、 D） 黄色の線で示した領域の横軸に沿った蛍光反応プロファイル。 左電極は（氏）と（D）。 （金利–F) dKeima と同じデータセットです。