Aureobasidium pullulansのN‐163株を経口摂取した後のmdx栄養障害マウスの線維症の解消によるβ‐グルカン生成

この研究は動物研究：in vivo実験報告ガイドラインに従って行われた。 C57BL/10SnSlcマウス（3週齢、オス）はJapan SLC, Inc.（日本）から購入しました。 C57BL/10-mdx/Jclマウス(3週齢、オス)はCLEA Japan(日本)から購入しました。 この研究で使用されたすべての動物は、動物福祉と管理に関する法律（環境省、1973年10月1日付法律第105号）、実験動物の管理および痛みの軽減に関する基準に従って管理されました。 （環境省告示第88号、2006年4月28日）および動物実験の正しい実施に関する指針（日本科学会、2006年6月1日）。

研究グループ

グループ1：一般

15匹のC57BL/10SnSlcマウスは、犠牲になるまで何の処置も受けなかった。

グループ2：車両

15匹のmdxマウスにビヒクルを経口投与した。 [pure water] 0日から45日まで1日1回10mL/kgの用量で投与します。

グループ3：N-163β-グルカン

15匹のmdxマウスにN-163株を補充したビヒクルを経口投与し、0日から45日まで1日1回APIとして3mg/kgのベータグルカンを10mL/kgの用量で生産した。

β-グルカン（Neu-REFIX™）を産生したN-163株はGYEN CO.、株式会社から提供された。 Ｎ−１６３β−グルカンにＲＯ水を適量添加し、完全に溶解するまで撹拌した。 溶液を７本のチューブに分注し、投与日まで４℃で保存した。 投与製剤を投与前に撹拌した。 投与製剤は７日以内に投与した。

• ビヒクルとＮ－１６３β－グルカンを１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与した。

• N-163β-グルカンは、1日1回3mg/kg APIの用量で投与した。

動物は、温度（２３±３℃）、湿度（５０±２０％）、照明（１２時間人工照明および暗黒周期、照明８：００〜２０：００）が制御された条件下でＳＰＦ施設で維持された。 、空気交換。 動物はTPXケージ（CLEA Japan）に収容され、ケージあたり最大5匹のマウスがありました。

寝具類はSterilized Paper-Clean（日本SLC）を使用し、週に1回交換してくれました。 滅菌された一般的な食事を自由に提供し、ケージの上部にある金属のふたに置いた。 RO水はゴム栓とシッパーチューブを備えたウォーターボトルから自由に供給されました。 ウォーターボトルは週に一度交換して洗浄し、オートクレーブで滅菌して再使用した。 耳パンチを使用してマウスを識別した。 各ケージには特定の識別コードが表示されます。 mdxモデルマウスは、治療開始前日の体重に基づいて15匹のマウスからなる2つのグループにランダムに割り当てられた。 Excelソフトウェアを使用して、体重階層化ランダムサンプリングを介してランダム化を実行しました。 mdxモデルのマウスを体重ごとに階層化してSDを得、グループ間の平均体重の差はできるだけ小さくした。

生存率、臨床徴候（無気力、痙攣、呼吸困難）および行動を毎日監視しました。 体重は治療前に毎日記録した。 投与前後にマウスにおいて有毒な、罹患率および死亡率の有意な臨床徴候が観察された。 動物は、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈を通る出血で45日に犠牲になりました。

試験が終了したら、尿サンプルを収集し（＞５０μＬ）、生化学のために－８０℃に保存した。 研究の終わりに、予備冷却されたシリンジを使用して腹部大静脈を介して非空腹時血液を収集した。 収集した血液を抗凝固剤（Ｎｏｖｏ−Ｈｅｐａｒｉｎ）を含む予め冷却したポリプロピレンチューブに移し、遠心分離するまで氷上に保管した。 血液サンプルを4℃で15分間1000×gで遠心分離した。 上清を収集し、生化学のために-80℃で保存した。

犠牲の後、大腿四頭筋、鼻腹筋、カザミ筋、足底筋、前景骨筋、腸支腎筋、横隔膜および心筋を収集した。 個々の筋肉重量を測定した。 以下のように各筋肉を分離し、解剖して保管した。

1. 1.

   トラガカンスガムをコルクディスクの上に置き、配向した筋肉の基礎を提供するのに十分なトラガカンスガムのみを使用した。

2. 2.

   一端にあるトラガカンス剣を筋肉の長軸がコルクディスクに垂直になるように配置しました。

3. 三。

   試料を急速冷凍し、液体窒素で冷却したイソペンタンに入れた。

4. 4.

   凍結したブロックをドライアイスに移し、イソペンタンを約１時間蒸発させた。

5. 5.

   凍結ブロックは-80℃で保存した。

血漿生化学測定

すべてのラットについて

血漿ALT、AST、LDH値は、FUJI DRI-CHEM 7000（Fujifilm Corporation）を用いて測定した。

サブGRの場合。 A(各グループでn=5)

血漿シスタチンCおよびTGF-βレベルは、市販のELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）キットを用いて測定した。

サブGRの場合。 B（各グループでn = 5）

血漿IL-13およびハプトグロビンレベルは、市販のELISAキットを用いて測定した。

尿生化学測定

すべてのラットについて

尿ミオグロビンおよびチチンレベルを市販のELISAキットで測定した。

ELISAキットを補足表1に示す。

組織学的分析

ロータリーミクロトーム（Leica Microsystems）を使用して、筋肉（TBD）組織のパラフィンブロックから切片を切断した。 セクションを分割した後、各スライドをブラインド評価のために数字でコーディングした。 各番号はExcelソフトウェアのRAND機能を使用して作成され、昇順にソートされ、スライドに割り当てられました。 組織スライドを染色に使用し、実験者によって評価した。

HE染色のために筋肉（前景骨筋）組織の凍結ブロックから切片を切り出した後、Lillie-Mayerのヘマトキシリン（Muto Pure Chemicals Co.、Ltd.、日本）およびエオシン溶液（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）で染色した。 。 炎症スコアはTinsleyの基準に従って計算した。⁹下の図のように：

炎症スコア

0 =なし〜最小 – 筋肉束または束間結合組織内に炎症がありません。 時には単核炎症細胞が存在する可能性がありますが、明確な凝集はありません。

1 =硬度 – 単核炎症細胞の局所集合を有する多発性結合組織の断続的な単核炎症細胞。

2 =中等度 – 多発間結合組織における単核炎症細胞浸潤の複数の病巣。 個々の筋繊維の間に断続的に単核炎症細胞が現れる。

3 = 重症 – 多発間および束内空間の拡大とともに多発間結合組織に拡張する多発間結合組織における単核炎症細胞浸潤の多数の大きな病巣。

マッソンの三色染色のために、冷凍筋肉（セプタム、7匹のマウス/グループ）セクションをWeigertの鉄ヘマトキシリン作業溶液（Sigma-Aldrich）、Biebrich Scarlet-Acid fuchsin溶液（Sigma-Aldrich）、リン酸タングステン/リンモリブデン酸溶液、アニリンブルーで染色した。 溶液および1％酢酸溶液（Sigma-Aldrich）。

線維症領域の定量的分析のために、マッソンの三色染色部分の明視野画像をデジタルカメラ（DFC295、Leica、Germany）を用いて200倍の倍率でキャプチャし、5つのフィールド/セクション（TBD）の陽性領域を以下を使用する。で測定しました。 ImageJソフトウェア（米国国立保健院）。

統計テスト

Prism Software 6(GraphPad Software, USA)を用いて統計分析を行った。 Bonferroniの多重比較試験を用いて統計分析を行った。 以下の群を比較した：（１）群２（車両）対群１（一般）および群３（Ｎ－１６３β－グルカン）。 統計的有意性は以下のように設定した。 血<0.05。 結果は平均±SDで表される。 単側ｔ検定が返されると、傾向または傾向が仮定された。 血– <0.1の値。 以下のグループを比較しました。

1. 1.

   グループ2（車両）対グループ1（一般）

2. 2.

   グループ2（車両）対グループ3（N-163β-グルカン）

倫理承認

プロトコル承認は、日本IACUCのSMC研究所（研究プロトコル番号：SP_SLMA143-2208-3）から取得しました。 この研究は動物研究：in vivo実験報告ガイドラインに従って行われた。 C57BL/10SnSlcマウス(3週齢、オス)はJapan SLC, Inc.(日本)から購入しました。 C57BL/10-mdx/Jclマウス(3週齢、オス)はCLEA Japan(日本)から購入しました。 本研究で使用されたすべての動物は、以下のガイドラインに従って管理されています。 88号、2006年4月28日）および動物実験の適切な実施に関する指針（日本科学会、2006年6月1日）。