ラット膿胸モデルにおける超微細オゾン気泡を用いた新しい胸腔内灌漑

オゾン-UFBを含む溶液の調製とオゾン濃度の測定

オゾン-UFB溶液は、2段階手順を用いて調製した。 まず、PZH-12Nオゾン生成装置（KOFLOC、日本京都）で無性放電システムを使用して空気と酸素を分離し、酸素からオゾンを生成しました。 第二に、一般食塩水溶液（NSS; Otsuka Pharmaceutical, Tokyo, Japan）でUFB生成装置（LIVING ENERGIES & Co., Shizuoka, Japan）を用いて電源を印加してオゾンを溶解させ、キャビテーションを発生させてオゾン-UFBを生成する。した。 。 〜3×10がありました⁸ 溶液ミリリットル当たりのＵＦＢ粒子及びＵＦＢ直径は１００～２００ｎｍであった。 UFBの数は3日以上テストするのに十分でした。 UFBの数は、NanoSightシステム（Malvern Panalytical、Malvern、UK）を使用して決定されました。 ＵＦＢサイズ分布を補足図１に示す。 オゾン-UFB NSSの溶存オゾン濃度は、補足図のように、室温(22℃)で非UFBオゾンを含むNSSの溶存オゾン濃度よりもゆっくりと減少した。 図2.過飽和オゾンは、オゾン-UFB NSSが生成されてから最初の10分間急激に揮発しましたが、その後オゾン濃度は徐々に減少し、1時間以上約1 mg / Lに維持されました。 対照的に、Non-UFBオゾンを含むNSSでは、10分後にオゾンはほとんど検出されなかった。

消毒を達成する時間

微生物

いくつかの微生物が畜農症を引き起こす¹⁷。 黄色ブドウ球菌ATCC 29213 （S. アウレウス^ATCC）と 緑膿菌ATCC 27853 （P. aeruginosa^ATCC）はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手したものです。 メチシリン耐性 S. アウレウス （MRSA）は京都大学病院の臨床サンプルから得たものです（MRSA）– 京都）。 ペプトストレプトコッカスアナエロビウスGTC 0201 （P.嫌気性^GTC）は、MEXT/AMED（日本）が運営する国家生物資源プロジェクト（病原性細菌）を通じて、気候大学微生物遺伝子資源保存センターから入手しました。 S. アウレウス^ATCC、 P. aeruginosa^ATCCおよびMRSA– 京都 トリプティカーゼ大豆寒天（BD、Franklin Lakes、NJ、USA）で35℃で1日間栽培しました。 P.嫌気性^GTC GAM寒天（Nissui Pharmaceutical、東京、日本）で36℃で3日間嫌気的に成長しました。

サンプルの準備

~1×10⁷ ２５℃でいくつかの濃度のうちの１つ（初期オゾン濃度が０．４ｍｇ ／ Ｌの溶液中で調製された）オゾン−ＵＦＢ ＮＳＳ０．９ｍＬに試験細菌１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を添加した。 オゾン-UFB NSSの殺菌効果を、0.5％クロルヘキシジングルコネート（CHX）（0.5％Hexizac Water W、Yoshida Pharmaceutical、Saitama、Japan）の殺菌効果と比較した。

次いで混合物を25℃で1分間インキュベートした。 オゾン-UFB NSSとCHXの殺菌効果を比較するテストでは、各溶液の殺菌効果の持続時間が異なるため、細菌懸濁液を1分間または10分間インキュベートしました。 CHXは混合溶液中で不活性化されなかったが、オゾン-UFB NSSは急速に不活性化された。 オゾン‐UFB NSSの殺菌効果 P.嫌気性^GTC そしてair-UFB NSSも比較された。

試験溶液に曝露した後の細菌コロニー数の計算

インキュベーション後、混合物の０．１ｍＬアリコートを滅菌ペトリ皿に移し、約２０ｍＬのトリプチカーゼ大豆寒天培地と混合し、次いで混合物を３５℃で１日間インキュベートした。 S. アウレウス^ATCC、 P. aeruginosa^ATCCおよびMRSA– 京都）または２０ｍＬのＧＡＭ寒天培地と混合し、嫌気性条件下で３６℃で３日間インキュベートする。 P.嫌気性^GTC）。 オゾン-UFBとCHX溶液を比較するために行った試験では、混合物の0.1mLアリコートを無菌ペトリ皿に移し、ポリソルベート80とレシチンを含むトリプシン大豆寒天20mLと混合して試験を不活性化した。 。 溶液にした後、混合物を35℃で2日間インキュベートした。 その後、形成されたコロニーの数を数えた。 最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を計算した。 MBCは S. アウレウス^ATCC そして P. aeruginosa^ATCC Non-UFBオゾン溶液とオゾン-UFB溶液を比較した。

細菌およびアルブミン含有溶液に対するオゾン‐UFB溶液の殺菌効果

溶解したオゾンは有機物によって容易に不活性化されるので、以下を含む溶液中のオゾン-UFB溶液の殺菌効果を評価した。 S. アウレウス^ATCC 農胸の胸腔内環境を模倣した体外試験におけるアルブミン。

様々なアルブミン濃度におけるオゾン‐UFB溶液の殺菌効果

〜10を含む培地の50μLアリコート⁷ CFU/mL S. アウレウス^ATCC ウシアルブミン（Serologicals Corporation、Norcross、GA、USA）を含むNSSと10％、5％、1％、または0.1％の濃度で混合した。 次いで、混合物の０．１ｍＬアリコートを０．９ｍＬのオゾン−ＵＦＢ溶液（オゾン濃度０．５ｍｇ／Ｌ）に添加し、次いで混合物を２５℃で１０分間インキュベートした。 混合物の０．１ｍＬアリコートを滅菌ペトリ皿に移し、２０ｍＬのトリプチカーゼ大豆寒天培地と混合し、次いで混合物を３５℃で１日間インキュベートし、コロニー数を計算した。

以下を含む溶液にオゾン-UFB溶液を数回添加した場合の殺菌効果 S. アウレウス とアルブミン

〜10を含む培地の50μLアリコート⁸ CFU/mL S. アウレウス^ATCC ウシアルブミンを１０％濃度で含有したＮＳＳと混合した。 次いで、混合物の０．１ｍＬアリコートを０．９ｍＬのオゾン−ＵＦＢ溶液（オゾン濃度０．７〜１．０ｍｇ／Ｌ）に添加した。 次に混合物の０．１ｍＬアリコートを０．９ｍＬのオゾン−ＵＦＢ溶液を含むチューブに移し、同じ希釈をさらに２回繰り返した。 各混合物について、０．１ｍＬのアリコートをペトリ皿に無菌的に移し、２０ｍＬのトリプチカーゼ大豆寒天培地と混合し、次いで混合物を３５℃で１日間インキュベートした。 その後、コロニーを数えた。

ラット膿胸モデル

準備

京都にある京都大学医学大学院実験動物研究所で管理された実験が行われました。 研究プロトコルとすべての手順は、京都大学倫理委員会（承認番号Med Kyo 21306）によって承認されました。 動物は連邦決議の04/97に規定された実験動物管理の原則に従って人道的管理を受けた。 この研究はARRIVEガイドラインに準拠して行われました。 体重がそれぞれ280～330gの雄ルイスラットをランダムに選択しました。 ラットサプライヤーは日本SLC（浜松、日本）でした。 オゾン-UFBを用いた胸腔内洗浄の効果をラット膿胸モデルを用いたNSSによる洗浄の効果と比較した。 S. アウレウス^ATCC （膿胸の最も一般的な原因の1つ）。 ラット膿胸モデルは、細菌を含むNSS 1.0 mLを胸腔内注射することによって作られた（〜10⁸ CFU S. アウレウス^ATCC）。 手術後の癒着を避けるために、小さな開腹術を行い、横隔膜を通して細菌溶液を右胸腔に注入した。 全ての手順は滅菌技術を用いて行った。

治療と評価

2日後 S. アウレウス^ATCC 十分な量の胸膜化膿性滲出液（≧０．５ｍＬ）を有するラットを注射した。 S. アウレウス^ATCC 培養後に検出された液体は膿胸があると定義した。 この膿胸モデルでは追加の生存が予想されなかったため、すべてのラットを致死量のイソフルランを吸入させて犠牲にしました。 ラットを横方向の渦巻き位置に置いた。 皮膚消毒は７０％エタノールに続いて１０％ポビドンヨウ素で施行した。 以下の手順は、滅菌された物質を用いて無菌方式で行った。 全胸腔を検査するために、いくつかの肋骨を切除した右開胸術を実施した。 胸腔両側で胸膜滲出が発生したので縦隔胸膜を除去し、両胸膜滲出液を全て採取した。

滲出物を集めた後、NSSで希釈したユーロキナーゼ（Mochida Pharmaceutical、東京、日本）3mLを用いて10分間、10分間2回洗浄して浮遊有機物を除去した。 次に、胸腔をオゾン-UFB NSSまたはNSSで2分間充填した。 これが15回も繰り返されました。 オゾン濃度が３～４ｍｇ／Ｌのオゾン－ＵＦＢ ＮＳＳを洗浄手順に使用した。 洗浄が１５回行われた後、胸腔（２群の各ラット）をＮＳＳで２分間満たした。 最初、５番目、１０番目および最後のＮＳＳ洗浄液の液体をインキュベートした。 胸膜滲出液およびユーロキナーゼ洗浄液をそれぞれ100倍に希釈し、浸漬液をNSSでそれぞれ10倍に希釈した。 サンプルの０．１ｍＬアリコートを滅菌ペトリ皿に移し、２０ｍＬのトリプチカーゼ大豆寒天培地と混合し、次いで混合物を３５℃で１日間インキュベートした。 その後、コロニーを数えた。 個体数が減る S. アウレウス^ATCC 最初、5番目、10番目、および最後のNSS浸漬液を測定し、初期胸膜滲出液およびユーロキナーゼ洗浄液の総細菌数と比較した。

生体内毒性研究

体重280～330gの雄Lewisラットを用いて、膿胸モデルと同様に開腹術を行った。 オゾン濃度９～１０ｍｇ／Ｌのオゾン－ＵＦＢを含むＮＳＳ１．０ｍＬアリコートまたはＮＳＳ（対照群）１．０ｍＬアリコートを横隔膜を通して胸腔内に注入した。 注入された液体を収集せずに切開を閉じ、24時間後に毒性を評価した。

液体を注入して２４時間後にラットを殺し、各ラットの下大静脈から血液サンプルを採取した。 血清サンプルのインターロイキン-6（IL-6）濃度を測定して炎症を示すために使用した。 LEGEND MAX™Rat IL-6 ELISAキット（Biolegend、San Diego、CA、USA）を用いて酵素結合免疫吸着アッセイを行い、IL-6濃度を測定した。 炎症の変化を評価するために、組織病理学的検査のために右下肺葉、心臓、肝臓および右腎臓を切除しました。 組織サンプルを10％ホルマリンに固定し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。 介入前および24時間後に各ラットの体重を測定した。

統計分析

特に明記しない限り、各結果は中央値と四分位数の範囲で表されます。

グループペアの結果は、カテゴリーデータのFisherの正確なテストとMann-Whitneyの実行によって比較されました。 ゆう 非パラメータ変数のテスト Wilcoxon符号順位テストはMBCを比較するために使用された。 S. アウレウス^ATCC そして P. aeruginosa^ATCC 非UFBオゾンおよびオゾンUFBソリューション用。 血＜０．０５は統計的に有意な結果を示すと考えられた。 統計分析は、EZR統計ソフトウェア（日本埼玉県秩序医科大学埼玉医療センター）を用いて行った。